Bioquímica Lab. 02 2018-0

Información

Curso	Laboratorio de Bioquímica (Guía)
Profesor	Carmen Orihuela Rivera
Práctica	02 - Determinación del punto isoeléctrico de la caseína. [PDF]
Fecha	2018.01.30 Martes

AVISO: Este post no es una referencia. Deben usarse las referencias descritas al final.

1. Resumen

El presente informe tiene como objetivo determinar el punto isoeléctrico de la caseína, basado en la acción de una solución buffer de CH3COOH/CH3COONa, teniendo en cuenta que la caseína precipita en medio ácido a un valor de pH cercano a 4.6.
Para el desarrollo de la práctica se formó una serie de 10 tubos. En los que se agregaron diferentes concentraciones de ácido acético a una misma cantidad de solución de caseína. La caseína formó un precipitado más notorio y de manera más rápida en los tubos 2 y 3 a valores experimentales de pH = 4.7 y 4.9, muy cercanos al pH = 4.6 esperado.
El hecho de que el pH del punto isoeléctrico fuera ácido, se atribuye al gran número de grupos carboxilo (-CH3COOH) que se adoptan su forma neutra en medios ácidos.
Aunque la solución inicial presentaba cierta turbidez y los valores experimentales de pH en cada tubo diferían de los valores teóricos. El resultado fue muy cercano al esperado, con un márgen de error cercano al 4.2%.

2. Introducción

El punto isoeléctrico se define como el pH en el cual el número de cargas positivas se iguala al número de cargas negativas que aportan los grupos ionizables de una molécula. En el punto isoeléctrico la carga neta de la molécula es cero (0). En los aminoáci­dos los grupos ionizables corresponden a grupos carboxilos, amino, fenólicos y  tiólicos.
Los puntos isoeléctricos proporcionan información útil para razonar sobre el comportamiento de los aminoácidos y proteínas en solución. Así, la presencia de grupos ionizables en estas moléculas tiene importantes consecuencias sobre la solubilidad. Los aminoácidos y las proteínas son menos solubles en su punto isoeléctrico si las demás condiciones permanecen iguales. Esto se debe a que los iones dipolares no presentan carga neta y cristali­zan en forma de sales insolubles a ese pH.

3.    Principios Teóricos

Las proteínas debido a que están compuestas totalmente o en su mayor parte por aminoácidos, los cuales  poseen propiedades que reflejan las propiedades generales de la proteína.

3.1. Propiedades ácido-base de los aminoácidos

En una disolución acuosa loa aminoácidos forman iones dipolares, un ion dipolar se comporta como acido o como base según el pH de la disolución. Las sustancias que poseen esta propiedad se denominan anfóteras. 

Fig. 01 Ión Zwitterión

3.2. Punto isoeléctrico

Aunque la mayoría de los grupos carboxilos y los grupos aminos de los aminoácidos se encuentran bloqueados cuando se encuentran unidos para formar uniones peptídicas, siempre quedan libres algunos de estos grupos, ya sea en los extremos de las cadenas polipeptídicas, o en las cadenas laterales de los aminoácidos acíclicos y básicos. La disociación de los grupos ionizables que están presentes en las proteínas ocurre como en el caso de los grupos ionizables de los aminoácidos individuales y es gobernada por el pH del medio en el que se encuentra la proteína. A pH = 7.1 o en valores cercanos son los habituales en la mayoría de células, los grupos carboxilo de los ácidos aspártico y glutámico se encuentran en sus formas básicas cargadas negativamente, mientras que los aminoácidos lisina y arginina están presentes en su forma acíclica, cargadas positiva.
Cuando el pH de la solución es tal que la carga neta de la molécula proteica es cero, es decir, cuando el número de total de cargas negativas iguala a número total de cargas positivas presentes en la molécula, se llama a este valor de pH, punto isoeléctrico de la proteína. [1]

Proteína	pHI
Pepsina Albúmina Lactoglobulina Hemoglobulina Quimotripsina Ribonucleosa Citocromo C Lisozima	1.0 4.7 5.1 6.7 8.3 9.5 10.7 11.0

Fig. 02  Valores de pH isoeléctrico para algunas proteínas. [1]

3.3. Caseína

Es el nombre de un grupo de proteínas en la leche. Las Caseínas están presentes en toda leche animal, incluyendo la humana. En la leche de vaca casi el 80% de las proteínas son caseínas, o alrededor de 26 g/l.
Las Caseínas son divididas en cuatro sub-grupos caseína: as1-, as2-, ß- y κ- las cuales varían en una reducida cantidad de residuos aminoácido. Estas forman enlaces internos y se reacomodan formando micelas y floculas que ayudan a su precipitación (Fig.2). [2]

Fig. 03 A: miscela de caseina; a: una sub-miscela,  B: cadena sobresaliente, C: fosfato de calcio, D: k-caseina, E: grupos fosfatos [3]

La cisteína se compone de diversos residuos aminoácidos entre los que destaca el glutamato y la leucina que forma puentes (Fig.9).

4.    Detalles Experimentales

4.1.    Materiales

• 10 Tubos de ensayo grandes.
• 2 pipetas de 1 mL y de 5 mL,
• Bombilla succionadora
• Gradilla
• Cintas de pH
• Matraz aforadoCalculadora.

4.2.    Reactivos

Leche fresca (caseína)
CH3COONa
CH3COOH

4.3.    Procedimiento experimental

Inicialmente se preparó la muestra de caseína. Para ello se solubilizo la leche con agua desionizada y dejo reposar la solución (Fig. 4).

FIG. 4 Solucion de caseina. Sin turbidez.
1)    Se preparó en una gradilla, 9 tubos de ensayo de acuerdo a la siguiente tabla. [5]
Tabla 1

6. Discusión de Resultados

Una vez que se prepararon todos los tubos de acuerdo a la Tabla 1, se observó que, de acuerdo a la Tabla 2 los tubos 02 y 03 presentaron la mayor turbidez. El tubo 02 posee un pH = 4.7, mientras que el tubo 03 tiene un pH = 4.9. Por lo que el pI se encuentra aproximadamente en pH = 4.8.

La caseína representa el 80% de las proteínas presentes en la leche, estas proteínas precipitan del líquido cuando esta toma un pH ácido de 4,6 a 4.7 aproximadamente. Nuestros resultados concuerdan con los valores teóricos con un margen de error del 4.3%.

La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, a ese pH la caseína está cargada negativamente y se solubiliza como sal cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita. [5]

Las proteínas que aparecen en el líquido sobrenadante cuando se precipita la caseína en medio ácido son proteínas globulares, hidrofilicas y fácilmente solubles en agua así como susceptibles de desnaturalización por calor. [5]

Fig. 07 pI del ácido glutámico.

La presencia de Glu en el 21% en peso de la composición de la cisteína influye, pues la acidificación con iones acetato, además de disminuir el pH, desplazara el equilibrio hacia el restablecimiento de los radicales –COOH. (Fig.7) Además, la caseína formara micelas, y a medida que el pH se acerque a 4.8, formara pequeños floculas que facilitaran la precipitación (Fig.8). [3]

Fig. 08

7. Conclusiones

• La caseína precipitó en medio acético a pH = 4.8. El margen de error con respecto a su valor teórico de pH = 4.6 fue de cerca del 4.3%.
• Se comprobó experimentalmente que el punto isoeléctrico se da en un determinado valor (o intervalo) de pH y que tanto por encima, como por debajo de este valor, la proteína se mantiene en forma iónica y es más soluble.
• Se observó que la solubilidad de las proteínas no depende únicamente del pH, sino que intervienen las propiedades del solvente. La caseína, a diferencia de otras proteínas, puede precipitar en solución acuosa, debido a que sus residuos aminoácidos mayoritarios (como el ácido glutámico / glutamato) son principalmente de naturaleza iónica.

8. Recomendaciones

• Las soluciones proteicas deben ser preparadas poco tiempo antes del experimento para evitar una posible modificación o degradación de las proteínas.
• Filtrar las muestras ayuda a evitar la interferencia de otros componentes (como la grasa de la leche) durante la experimentación.
• En el caso de la caseína, es importante dejarla reposar para que sedimenten los componentes que no son de interés.
• El pH de los tubos se midió cuando ya estaban con caseína, sin embargo, se recomienda hacerlo antes de que se agregue la muestra.

9. Referencias

1. Peña Díaz, A. Arroyo, B. Gómez, A. Tapia, R. Gómez, C. (2004). Bioquímica (2ª Ed.). México, D.F.: Limusa. [Google]
2. Costa da Silva, J. Pinho, S. C. (2013) Viability of the microencapsulation of a casein hydrolysate in lipid microparticles of cupuacu butter and stearic acid. International Journal of Food Studies, 2, 48–59.  [ResearchGate][PDF]
3. Gonzalez-Jordan, A. Thomar, P. Nicolai, T. Dittmer, J. (2015). The effect of pH on the structure and phosphate mobility of casein micelles in aqueous solution, Food Hydrocolloids, 51, 88-94 DOI
4. Food-Info, Pontificia Univ. Católica de Valparaíso. (26 Jul 2001). Proteínas de Leche.
5. Universidad Pablo de Olavide. Servidor FTP 
• Práctica 3 – Extracción de la caseína y determinación del punto isoeléctrico. [PDF]
6. Nelson, D. L. Cox, M, M. (2015) Lehninger Principios de Bioquímica (6ª Ed.). España, Barcelona: Ediciones Omega. Pág. 78, 90 – 91
7. Donald Voet, Judith G. Voet (2006) Bioquímica (3ª Ed.). España, Barcelona: Editorial Médica Panamericana. Pág. 140 – 141 [Google] 

9. Referencias

1. Describe dos métodos utilizados para separar proteínas. [6]
• Cromatografía de columna: Se hace pasar una solución tamponada que contiene a la muestra protéica (fase móvil) a través de una columna con un material sólido y poroso de propiedades químicas adecuadas (fase estacionaria) aprovechando la gravedad durante el proceso de separación. Según las características de la fase estacionaría, este método se puede denominar Cromatografía de intercambio iónico, Cromatografía de filtración en gel o Cromatografía de afinidad.
• Electroforesis: En este método se utiliza la fuerza de un potencial eléctrico para separar las proteínas de una muestra sobre geles de poliacrilamida que ralentizan el desplazamiento de las proteínas de manera proporcional a su cociente carga/masa. Este método se usa principalmente de forma analítica por su alta precisión, sin embargo, no se usa para separar cantidades notables de proteína debido a que puede modificar su estructura y existen métodos más sencillos.
2. ¿Qué importancia tiene conoce pI de las proteínas? Mencione pI de cinco proteínas.
• Cada proteína tiene un pH característico (denominado punto isoeléctrico o pI) en el cual las cargas positivas de la molécula se equilibran con exactitud con las cargas negativas, haciendo que la molécula no tenga ninguna carga neta y por lo tanto sea inmóvil en un campo eléctrico. [7] El punto isoeléctrico es aprovechado para poder separar a una proteína específica de otras proteínas con valores de pI diferentes. La proteína de interés se precipita en el pI correspondiente, mientras que las proteínas con otros valores de pI se mantienen en solución. Algunas proteínas con su respectivo pI se muestran a continuación.
• Ovoalbúmina (gallina) 4.6
• Insulina (bovina) 5.4
• Colágeno 6.6
• Hemoglobina (humana) 7.1
• Citocromo c (equino) 10.6 [7]
3. ¿Qué efecto cumplió el buffer acetato en la determinación del pI de la caseína?
• El buffer de acetato tiene la función de mantener el pH estable una vez que se agrega la caseína a la solución. Como se mencionó anteriormente, la leche posee un pH = 6.6, en el cuál el gran número de grupos carboxilo presentes en la caseína se encuentran en su forma aniónica.
  Al acidificar el medio, estos grupos carboxilos retoman su forma neutra, alterando el pH de la solución. 
4. Dado el péptido siguiente: Ser-Glu-Pro-Ile-Met-Ala-Pro-Val-Glu-Tyr-Pro-Lys
   Escribir la secuencia utilizando una letra.
   S – E – P – I – M – A – P – V – E – Y – P – K  [6]

11. Apéndice

Fig. 09 Composición de aminoácidos de la caseína hidrolizada: Glx (glutamato + ácido glutámico): 21 %; prolina: 10.2 %; leucina: 8.7 %; lisina: 7.3 % (% peso). [2]