Bioquímica - R14 - Obtención de desoxirribonucleoproteínas
Práctica 14
Bioquímica - Práctica 14
Obtención de dexosirribonucleoproteínas (DRNP) del bazo y reacciones cualitativas sobre los productos de su hidrólisis.
Resumen
El presente informe tiene como objetivo la obtención de obtención de dexosirribonucleoproteínas (DRNP) del bazo y reacciones cualitativas sobre los productos de su hidrólisis además de realizar reaccione de coloración sobre los productos de la hidrólisis y observar las características.
Para el desarrollo de esta práctica en primer lugar se preparó la muestra, para lo cual han molido 2 g de bazo por 15 minutos con arena. Se agregó NaCl 2M, previamente enfriado, y luego pequeñas porciones de NaCl 1M. La masa obtenida se agitó fuertemente por algunos minutos. Al volumen obtenido se le añade un volumen de agua seis veces mayor.
Se procedió a la reacción de la muestra y de la ribosa con la difenilamina. Luego de someterse a hidrólisis ácida en caliente, se observó la coloración azul característica en la muestra de desoxirribosa del bazo, sin embargo no se pudo observar la coloración verde de la ribosa.
Se procedió a la reacción de la muestra y de la ribosa con la difenilamina. Luego de someterse a hidrólisis ácida en caliente, se observó la coloración azul característica en la muestra de desoxirribosa del bazo, sin embargo no se pudo observar la coloración verde de la ribosa.
Introducción
Desde el punto de vista químico, los ácidos nucleicos son macromoléculas formadas por polímeros lineales de nucleótidos, unidos por enlaces éster de fosfato, sin periodicidad aparente. De acuerdo a la composición química, los ácidos nucleicos se clasifican en Ácidos Desoxirribonucleicos (ADN) que se encuentran residiendo en el núcleo celular y algunos organelos, y en Ácidos Ribonucleicos (ARN) que actúan en el citoplasma.
Son las moléculas que tienen la información genética de los organismos y son las responsables de su transmisión hereditaria. El conocimiento de la estructura de los ácidos nucleicos permitió la elucidación del código genético, la determinación del mecanismo y control de la síntesis de las proteínas y el mecanismo de transmisión de la información genética de la célula madre a las células hijas.
Existen dos tipos de ácidos nucleicos, ADN y ARN, que se diferencian por el azúcar (Pentosa) que llevan: desoxirribosa y ribosa, respectivamente. Además se diferencian por las bases nitrogenadas que contienen, Adenina, Guanina, Citosina y Timina, en el ADN; y Adenina, Guanina, Citosina y Uracilo en el ARN. Una última diferencia está en la estructura de las cadenas, en el ADN será una cadena doble y en el ARN es una cadena sencilla
Son las moléculas que tienen la información genética de los organismos y son las responsables de su transmisión hereditaria. El conocimiento de la estructura de los ácidos nucleicos permitió la elucidación del código genético, la determinación del mecanismo y control de la síntesis de las proteínas y el mecanismo de transmisión de la información genética de la célula madre a las células hijas.
Existen dos tipos de ácidos nucleicos, ADN y ARN, que se diferencian por el azúcar (Pentosa) que llevan: desoxirribosa y ribosa, respectivamente. Además se diferencian por las bases nitrogenadas que contienen, Adenina, Guanina, Citosina y Timina, en el ADN; y Adenina, Guanina, Citosina y Uracilo en el ARN. Una última diferencia está en la estructura de las cadenas, en el ADN será una cadena doble y en el ARN es una cadena sencilla
Principios Teóricos
Ácidos nucléicos
Los Ácidos Nucleicos son las biomoléculas portadoras de la información genética. Son biopolímeros, de elevado peso molecular, formados por otras subunidades estructurales o monómeros, denominados Nucleótidos.
Los ácidos nucleicos están formados por largas cadenas de nucleótidos, enlazados entre sí por el grupo fosfato. El grado de polimerización puede llegar a ser altísimo, siendo las moléculas más grandes que se conocen, con moléculas constituidas por centenares de millones de nucleótidos en una sola estructura covalente. De la misma manera que las proteínas son polímeros lineales aperiódicos de aminoácidos, los ácidos nucleicos lo son de nucleótidos. La aperiodicidad de la secuencia de nucleótidos implica la existencia de información. De hecho, sabemos que los ácidos nucleicos constituyen el depósito de información de todas las secuencias de aminoácidos de todas las proteínas de la célula. Existe una correlación entre ambas secuencias, lo que se expresa diciendo que ácidos nucleicos y proteínas son colineales; la descripción de esta correlación es lo que llamamos Código Genético, establecido de forma que a una secuencia de tres nucleótidos en un ácido nucleico corresponde un aminoácido en una proteína.
Los ácidos nucleicos están formados por largas cadenas de nucleótidos, enlazados entre sí por el grupo fosfato. El grado de polimerización puede llegar a ser altísimo, siendo las moléculas más grandes que se conocen, con moléculas constituidas por centenares de millones de nucleótidos en una sola estructura covalente. De la misma manera que las proteínas son polímeros lineales aperiódicos de aminoácidos, los ácidos nucleicos lo son de nucleótidos. La aperiodicidad de la secuencia de nucleótidos implica la existencia de información. De hecho, sabemos que los ácidos nucleicos constituyen el depósito de información de todas las secuencias de aminoácidos de todas las proteínas de la célula. Existe una correlación entre ambas secuencias, lo que se expresa diciendo que ácidos nucleicos y proteínas son colineales; la descripción de esta correlación es lo que llamamos Código Genético, establecido de forma que a una secuencia de tres nucleótidos en un ácido nucleico corresponde un aminoácido en una proteína.
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| Fig. 1 |
Nucleoproteína
Una nucleoproteina es una proteína que está estructuralmente asociada con un ácido nucleico (que puede ser ARN o ADN). El ejemplo prototípico sería cualquiera de las histonas, que son identificables en las hebras de cromatina. Otros ejemplos serían la Telomerasa, una ribonucleoproteína (complejo de ARN/proteína) y la Protamina.
Su característica fundamental es que forman complejos estables con los
ácidos nucleicos, a diferencia de otras proteínas que sólo se unen a
éstos de manera transitoria, como las que intervienen en la regulación,
síntesis y degradación del ADN.
Ribonucleoproteína (RNP)
Es un complejo de ARN y proteína. La enzima telomerasa y los ribosomas son ejemplos notables. Los ribosomas consisten en una molécula de 50 o más proteínas ribosomales junto con tres moléculas diferentes de ARN en procariotas o cuatro en eucariotas.Desoxirribonucleoproteína (DRNP)
Es un complejo de ADN y proteína (principalmente histonas) en el cuál el ADN usualmente es hallado luego de la disrupción celular y aislamiento.
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| Representación esquemática del ensamblaje de histonas nucleares en el nucleosoma. A la derecha se muestra un nucleosoma completo. |
Las DRNP más extendidas son nucleosomas, en los que el componente es ADN nuclear. Las proteínas combinadas con ADN son histonas y protaminas; las nucleoproteínas resultantes están ubicadas en los cromosomas. Por lo tanto, todo el cromosoma, es decir, la cromatina en eucariotas, consiste en tales nucleoproteínas. Las protaminas reemplazan a las histonas durante la espermatogénesis.
Muchos virus son poco más que una colección organizada de DRNP.
Separación
Las DRNP se obtienen de tejidos ricos en núcleos
celulares (bazo, espermatozoides, etc). Estas se disuelven en soluciones
de sales de concentraciones medias, por ejemplo en NaCl 1
M, con la formación de soluciones viscosas y nuevamente se precipitan
por disolución de estas últimas (hasta 0.15 M) en forma de fibras de
nucleoproteína.
Materiales
En un recipiente se molieron 3 g de bazo de pollo con una cantidad similar de arena. Se agregaron 5 ml de NaCl 2.0 M y luego se añadieron 2 porciones de 50 ml de NaCl 0.1 M de forma paulatina. La molienda se prolongó por 15 minutos en baño de agua fria. Se trasvasó las masa obtenida a un tubo de ensayo y se agitó emulando un proceso de centrífuga. Finalmente se separó por decantación y se agregó agua desionizada al precipitado depositado.
2. Reacción con difenilamina
En un tubo de ensayo (Tubo 1) se colocó un poco de precipitado de ADN y se disolvióen 2 ml de NaOH 4%. A la solución se le agregó 2 ml de difenilamina y la mezcla se calentó en agua hirviendo por 15 minutos. En otro tubo (Tubo 2) se calentó con difenilamina, una solución de ribosa a la cuál se le habia agregado 2 ml de solucion de NaOH.
Tubo 1: Presenta una coloración rosada a medida que avanza el tiempo, tornándose azul luego de haber estado en el calor por 15 minutos.
Tubo 2: No presentó cambio de coloración en ningún momento.
Una hidrólisis ácida remueve todas las bases púricas (hidrólisis de uniones N-glicosídicas entre pentosa y las bases púricas) sin afectar las uniones fosfodiester del esqueleto nucleotídico, por lo tanto obtenemos como producto ácidos nucleicos sin bases púricas.
Las desoxipentosas debido a la hidrólisis ácida sufren deshidratación dando aldehídos δ-hidroxi-levulínicos. Estos reaccionan con difenilamina dando un producto de color azul. Así, la reacción de difenilamina servirá para caracterizar, indirectamente, la presencia de DNA.
Cuando se trata el ADN con difenilamina en condiciones ácidas, se forma un compuesto azul con una absorción definida máxima a 595 nm. Esta reacción la dan en general las 2-desoxipentosas y no es específica para el ADN. El mecanismo de esta reacción se puede ver en la siguiente imagen.
Pureba con Ribosa.
El mecanismo que se da a cabo es similar al de la desoxirribosa, no obstante el complejo final posee una estructura diferente, lo que explica la coloración verde.
Detalles Experimentales
Materiales
- Cocinilla
- Vaso de 250 ml
- Varillas de vidrio
- Probeta de 50 ml
Reactivos:
- Bazo de pollo
- Arena
- HCl 1N
- NaCl 0.1 M y 2.0 M
- NaOH 0.4 %
- Difenilamina
- Ribosa
Procedimiento:
1. Preparación de la muestraEn un recipiente se molieron 3 g de bazo de pollo con una cantidad similar de arena. Se agregaron 5 ml de NaCl 2.0 M y luego se añadieron 2 porciones de 50 ml de NaCl 0.1 M de forma paulatina. La molienda se prolongó por 15 minutos en baño de agua fria. Se trasvasó las masa obtenida a un tubo de ensayo y se agitó emulando un proceso de centrífuga. Finalmente se separó por decantación y se agregó agua desionizada al precipitado depositado.
2. Reacción con difenilamina
En un tubo de ensayo (Tubo 1) se colocó un poco de precipitado de ADN y se disolvióen 2 ml de NaOH 4%. A la solución se le agregó 2 ml de difenilamina y la mezcla se calentó en agua hirviendo por 15 minutos. En otro tubo (Tubo 2) se calentó con difenilamina, una solución de ribosa a la cuál se le habia agregado 2 ml de solucion de NaOH.
Resultados Experimentales
Tubo 1: Presenta una coloración rosada a medida que avanza el tiempo, tornándose azul luego de haber estado en el calor por 15 minutos.
Tubo 2: No presentó cambio de coloración en ningún momento.
Discusión de Resultados
Pureba con desoxirribosa.Una hidrólisis ácida remueve todas las bases púricas (hidrólisis de uniones N-glicosídicas entre pentosa y las bases púricas) sin afectar las uniones fosfodiester del esqueleto nucleotídico, por lo tanto obtenemos como producto ácidos nucleicos sin bases púricas.
Las desoxipentosas debido a la hidrólisis ácida sufren deshidratación dando aldehídos δ-hidroxi-levulínicos. Estos reaccionan con difenilamina dando un producto de color azul. Así, la reacción de difenilamina servirá para caracterizar, indirectamente, la presencia de DNA.
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| Estructura del ADN sin bases nitrogenadas. |
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| Mecanismo de reacción de la desoxiribosa con difenilamina. |
El mecanismo que se da a cabo es similar al de la desoxirribosa, no obstante el complejo final posee una estructura diferente, lo que explica la coloración verde.
Durante la práctica no se apreció la coloración azul, esto podría deberse a que el reactivo (ribosa) se encontraba contaminado o en mal estado.
Conclusiones
- Los ácidos nucleicos, en cualquier instancia, se encuentran asociados a proteínas formando nucleoproteínas.
- Para poder elucidar las propiedades de los ácidos nucleicos es preciso separarlos previamente de las proteínas.
Recomendaciones
- Se recomienda utilizar reactivo de difenilamina recién preparado. La solución, sin embargo, puede prepararse con anticipación y almacenarse en la oscuridad a baja temperatura.
- El ácido sulfúrico concentrado se debe pipetear cuidadosamente con una pipeta de vidrio de 5 ml con la ayuda de una pipeta en una campana extractora de químicos.
Referencias
- Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco (2017/11/11) Química Biológica I TP 8 DNA: extracción, identificación y reconocimiento. Recuperado de http://www.fcn.unp.edu.ar/sitio/quimicabiologica1/wp-content/uploads/2010/08/2011-TP-8-Extracci%C3%B3n-y-caracterizaci%C3%B3n-de-DNA.pdf
- NPTEL (2017/11/11) Lecture 6: Estimation of DNA using Diphenylamine Method. Recuperado de http://nptel.ac.in/courses/102103047/6
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